Como jefe de grupo en VacSal dirijo un proyecto que aborda distintos aspectos del desarrollo de vacunas bacterianas, en particular la destinada al control de la enfermedad denominada pertussis, tos convulsa o coqueluche. Pertussis es una enfermedad respiratoria inmunoprevenible que pese a más de 60 años de empleo masivo de vacunas continua siendo un problema para la salud pública no solo en nuestro país sino en otros, incluídos los más desarrollados. La problemática de pertussis se ha agravado en los últimos años y ello ha profundizado aún más la necesidad de revisar las estrategias de control y de desarrollar nuevas formulaciones vacunales. Así, el objetivo general de nuestro trabajo contempla entre otros el diseño de nuevas formulaciones más efectivas, no sólo en términos generales, sino en lo que se refiere a su efectividad en Argentina. Este objetivo está siendo abordado en la actualidad a través del desarrollo de diferentes líneas de ciencia básica y aplicada ya sea en forma autónoma o interdisciplinaria y en el contexto de la situación epidemiológica de la enfermedad en nuestro país. A continuación presentamos un breve resumen de las tareas que realizamos en el marco de cada una de dichas líneas:
a) Establecimiento del perfil epidemiológico de la enfermedad en nuestro país. Este trabajo lo venimos desarrollando como laboratorio Nacional de Referencia de Pertussis en el marco del Convenio ANLIS Malbrán – FCE UNLP y del PAE VacSal-ANPCyT. Cada año realizamos test diagnóstico para más de 2000 muestras clínicas provenientes de pacientes atendidos en distintos hospitales de nuestro País. Realizamos un asesoramiento continuo de los profesionales que conforman la red nacional en la patología. Hemos implementado un programa de aseguramiento de la calidad de las metodologías diagnósticas transferidas.
Trabajamos en el análisis de datos obtenidos del trabajo de vigilancia epidemiológica. Los resultados que obtenemos los difundimos mensualmente (www.vacunas-vacsal.org.ar). Las conclusiones extraídas han sido difundidas también en los trabajos y presentaciones a congreso que se incluyen más abajo. Nuestro trabajo además es sometido a controles de calidad internacional (CDC)
En el marco de la mutidisciplinariedad y de un trabajo conjunto con el equipo liderado por el Dr. Fabricius hemos desarrollado un modelo matemático de transmisión para evaluar entre otros el impacto que tendrían distintas medidas de control en la población más vulnerable (0 a 1 año). Los resultados alcanzados hasta el momento han sido ya difundidos en congresos internacionales y en revistas de la especialidad.
b) Identificación de las posibles causas de aumento de la enfermedad: caracterización molecular de aislamientos del agente causal Bordetella pertussis propios de nuestro región. Comparación con cepas que se emplean en la producción de vacunas. Estudio del rol de la divergencia entre la población bacteriana circulante y las cepas vacunales en la protección. Potencialidad para el diseño de nuevas vacunas. Este trabajo lo venimos desarrollando en el marco del Convenio Anlis Malbrán – FCE UNLP (2005-2014), PICT 2004 26201. PAE PICT 2007 y PID83. Mediante la plataforma metodológica de MLST que permite el análisis de los polimorfimos en un número mayor de secuencias estamos completando la caracterización de los aislamiento obtenidos durante el periodo que se informa. Nuestros resultados siguen evidenciando que el genotipo predominante que circula en la actualidad en nuestro país es ptx-p3, prn2 y fim3B, el cual se diferencia al del periodo anterior al año 2002 (periodo no epidémico), donde se observaba además la co-circulación de otras variantes alélicas (principalmente ptx-p1, prn1 y fim3A). Esta variación en los genotipos circulantes ha sido detectada en otros países luego de más de cincuenta años de inmunización masiva con vacuna anti-pertussis. La disminución de la diversidad en las variantes alélicas circulantes para los antígenos protectores toxina pertussis, pertactina y fimbria 3 podría responder a la presión de selección ejercida por las vacunas.
Recientemente hemos incorporado técnicas que nos permiten detectar las mutaciones descriptas para el gen de la pertactina. Se ha observado que los aislamientos que circulan en los paises que se ha incorporado la vacuna acelular para todo el calendario han dejado de expresar esta proteína que está incluida en dichas formulaciones vacunales. Se ha propuesto que la aparición de estos aislamientos ha ocurrido en respuesta de la presión de selección ejercida por dichas formulaciones acelulares. En este contexto hemos implementado ensayos de PCR y de inmunoblot para detectar estas alteraciones a nivel local. Hasta la fecha hemos detectado sobre un total de 150 aislamientos, 6 aislamientos que no expresan pertactina. La proporción hasta ahora detectada es significativamente menor que la registrada para países como USA y Australia que ha diferencia nuestra han reemplazado completamente la vacuna celular por la acelular. La implicancia de estos resultados hemos comenzado a evaluarlo mediante ensayos in vitro e in vivo.
c) Caracterización de la interacción bacteria–hospedador: identificación de componentes bacterianos y caracterización de la respuesta inmune (innata y adaptativa) del huésped frente a infecciones de Bordetella, que se desarrolla en el marco del PAE ANPCYT.
En la actualidad estamos trabajando sobre el fenómeno denominado protección por estimulación de la respuesta innata (en inglés StIR) que hemos podido describir recientemente en B. pertussis. Durante el periodo que se informa estudiamos los posibles mecanismos que desencadenan este fenómeno que permite la eliminación temprana del patógeno. Hemos observado que aunque el reclutamiento de neutrófilos es evidente a tiempos muy tempranos del fenómeno, los ensayos de depleción de neutrofilos utilizando un anticuerpo anti-GR1 mostraron que el clearence bacterianos provocado por el LPS ocurre aún en ausencia de neutrófilos. Para evaluar el posible papel de los radicales libres en el fenómeno STIR, hemos realizado ensayos in vivo pero empleando mezclas de LPS con el inactivador de especies oxidantes, la N-acetil cisteína (NAC). En estos ensayos pudimos detectar que la administración NAC evita el clearence de B. pertussis inducida por LPS. Estos resultados muestran que las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel esencial en el aclaramiento innata TLR4 dependientes de B. pertussis. En la actualizad estamos analizando las poblaciones celulares que podrían estar involucradas en este fenómeno mediado por el LPS y las especies reactivas al oxígeno. Los resultados alcanzados ya han sido publicados como hemos detallado más abajo.
En el modelo Bordetella bronchiseptica huésped se está avanzando en la caracterización del rol del segundo mensajero c-di-GMP en la regulación de diferentes fenotipos. Esta línea está siendo llevada a cabo por los investigadores Federico Sisti y Julieta Fernández.
d) Identificación de candidatos vacunales, que se desarrolla en el marco del FP6-2004-INCO-DEV-3, PICT 2004 y PAE PICT 2007 29. Recientemente hemos trabajado en el análisis de la capacidad protectora de la proteína recombinante fimbria 2 de Bordetella pertussis (fim2) fusionada a la subunidad B de la toxina colerica (CTB). Para este fin, la secuencia que codifica para la fimbria 2 fue clonada aguas abajo de la subunidad B de la toxina del cólera. La expresión de la proteína de fusion y el análisis de su conformación pentamerica fue evaluada mediante corridas electroforeticas en geles SDS-PAGE y ensayos de ELISA. Los resultados obtenidos confirmaron el tamaño esperado para la proteína de fusión y la preservación de la estructura CTB pentamérica. Para evaluar la capacidad protectora de la CTB-fim2 empleamos el modelo el modelo animal de ratones con desafío intranasal. Los resultados obtenidos mostraron que los ratones inmunizados con CTB-fim2 por vía intranasal o por vía intraperitoneal presentaron una reducción significativa en los recuentos bacterianos de pulmón en comparación con los grupos control (p < 0,0001 y p < 0,001, respectivamente). Análisis de isotipos de IgG sugiere que la respuesta provocada por los diferentes inmunizaciones presentó un perfil de Th1/Th2 mixto. Los datos presentados aquí muestran la reversión del pobre poder inmunogenico de la proteína recombinante fim2 en el contexto de una proteína de fusion. Los resultados alcanzados han sido publicados en revistas internacionales con referato.
Estamos avanzando también en la caracterización de una formulación acelular desarrollada por nosotros constituida por componentes proteicos y no proteicos de B. pertussis. En particular hemos trabajado en la caracterización de una formulación que además del componente pertussis antes descripto contiene un componente similar pero derivado de B. parapertussis. El objetivo de dicha incorporación fue intentar extender la protección hacia esta otra especie del género Bordetella que también induce una enfermedad muy similar a la causada por B. pertussis pero para la cual no existe una formulación vacunal efectiva.
Los resultados alcanzados nos han permitido definir una formulación que protege contra las dos especies de manera muy satisfactoria y que además es biosegura. Estos han sido objeto de la presentación de una patente a nivel nacional e internacional que en la actualidad se encuentra en evaluación.
Parte de los resultados han sido divulgados en congresos y han sido publicados en revistas con referato internacional.